1. যে কোষগুলিকে ক্রায়োপ্রেসার করা হবে সেগুলি ভাল বৃদ্ধির অবস্থায় থাকা উচিত (লগ ফেজ) এবং উচ্চ বেঁচে থাকার হার, যার ঘনত্ব প্রায় 80-90%।
2. হিমায়িত হওয়ার আগে কোষগুলি এখনও তাদের অনন্য বৈশিষ্ট্যগুলি ধরে রেখেছে কিনা তা পরীক্ষা করুন৷
উদাহরণস্বরূপ, ক্রাইওপ্রিজারেশনের এক থেকে দুই দিন আগে অ্যান্টিবডি উৎপাদনের জন্য হাইব্রিডোমা পরীক্ষা করা উচিত।
3. cryoprotectant এর মানের দিকে মনোযোগ দিন।
DMSO হতে হবে রিএজেন্ট গ্রেড, জীবাণুমুক্ত এবং বর্ণহীন (0.22 মাইক্রন FGLP টেলফ্লন দিয়ে ফিল্টার করা বা সরাসরি কেনা জীবাণুমুক্ত পণ্য, যেমন সিগমা D-2650), 5-10 মিলি ছোট ভলিউমে অ্যালিকোট করা, অন্ধকারে 4 oC তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা। একাধিকবার ডিফ্রস্ট করবেন না। গ্লিসারলও রিএজেন্ট গ্রেডের হওয়া উচিত এবং অটোক্লেভিংয়ের পরে অন্ধকারে সংরক্ষণ করা উচিত। খোলার পরে এক বছরের মধ্যে ব্যবহার করুন, কারণ এটি দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজের পরে কোষের জন্য বিষাক্ত হবে।
4. cryopreservation জন্য কোষ ঘনত্ব:
(1) সাধারণ মানুষের ফাইব্রোব্লাস্ট: 1~3 x 106 কোষ/মিলি
(2) হাইব্রিডোমা: 1~3 x 106 কোষ/মিলি, কোষের ঘনত্ব খুব বেশি হওয়া উচিত নয়, কিছু হাইব্রিডোমা 24 ঘন্টা গলানো পরে মারা যাবে উচ্চ জমাট ঘনত্বের কারণে।
(3) অনুগত টিউমার লাইন: 5~7 x 106, কোষের ধরণের উপর নির্ভর করে। Adenocarcinoma গলানোর পরে একটি উচ্চ ঘনত্ব প্রয়োজন, যখন HeLa শুধুমাত্র 1-3 x 106 কোষ/ml প্রয়োজন।
(4) অন্যান্য সাসপেনশন: 5~10 x 106 কোষ/ml, মানুষের লিম্ফোসাইট কমপক্ষে 5 x 106 কোষ/ml হতে হবে।
5. cryoprotectant ঘনত্ব 5 বা 10% DMSO। কোষের হিমায়িত অবস্থা অনিশ্চিত হলে, হিমায়িত ব্যর্থতা রোধ করতে ক্রায়োপ্রিজারভিংয়ের সময় একটি ব্যাকআপ সংস্কৃতি ব্যবহার করা উচিত।
6. হিমায়িত পদ্ধতি:
(1) প্রথাগত পদ্ধতি: 4 oC 10 মিনিট ---> -20 oC 30 মিনিট ---> -80 oC 16-18 ঘন্টা (বা রাতারাতি) ---> তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্কের বাষ্প পর্যায়ে দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজ .
(2) প্রোগ্রাম কুলিং: -1 ~ -3 oC/মিনিট হারে ঘরের তাপমাত্রা থেকে -120 oC-তে কমাতে একটি ধ্রুবক-গতির কুলিং মেশিন ব্যবহার করুন এবং এটি দীর্ঘ সময়ের জন্য একটি তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্কের বাষ্প পর্যায়ে সংরক্ষণ করুন। মেয়াদী স্টোরেজ। এটি সাসপেনশন কোষ এবং হাইব্রিডোমা সংরক্ষণের জন্য উপযুক্ত।
7. উপাদান:
(1) সভ্য কোষ যা ভালভাবে বৃদ্ধি পায়
(2) তাজা মাধ্যম
(3) DMSO (সিগমা D-2650)
(4) জীবাণুমুক্ত প্লাস্টিক ক্রায়োপ্রিজারভেশন টিউব (নালজিন 5000-0020)
(5) 0.4% w/v ট্রাইপ্যান নীল (GibcoBRL 15250-061)
(6) হেমোসাইটোমিটার প্লেট এবং কভার গ্লাস
(7) ধ্রুবক বেগ কুলিং মেশিন (KRYO 10 সিরিজ II)
8. পদক্ষেপ:
(1) হিমায়িত হওয়ার একদিন আগে অর্ধেক বা পূর্ণ পরিমাণ মাঝারি পরিবর্তন করুন এবং কোষের বৃদ্ধি পর্যবেক্ষণ করুন।
(2) ক্রায়োপ্রিজারভেশন দ্রবণ প্রস্তুত (ব্যবহারের আগে প্রস্তুতি): তাজা মাধ্যমে DMSO যোগ করুন, চূড়ান্ত ঘনত্ব 5-10%, ভালভাবে মিশ্রিত করুন এবং পরে ব্যবহারের জন্য এটি ঘরের তাপমাত্রায় রাখুন।
(3) কোষের সাবকালচারের ক্রিয়াকলাপ অনুসারে, সংষ্কৃত কোষগুলি সংগ্রহ করুন এবং হিমায়িত হওয়ার আগে কোষের ঘনত্ব এবং বেঁচে থাকার হার গণনা করতে অল্প পরিমাণ সেল সাসপেনশন (প্রায় 0.1 মিলি) নিন।
(4) সেন্ট্রিফিউজ করুন, সুপারনাট্যান্ট অপসারণ করুন, কোষের ঘনত্ব 1-5 x 106 কোষ/মিলি করতে উপযুক্ত পরিমাণে ক্রায়োপ্রিজারভেশন দ্রবণ যোগ করুন, ভালভাবে মিশ্রিত করুন এবং লেবেলযুক্ত ক্রায়োপ্রিজারভেশন টিউব, 1 মিলি/শিশিতে ছড়িয়ে দিন এবং একটি ছোট নিন। দূষণ সনাক্তকরণের জন্য সেল সাসপেনশনের পরিমাণ।
(5) Cryopreservation পদ্ধতি 1: ক্রায়োটিউব 10 মিনিটের জন্য 4 oC তে → -20 oC 30 মিনিটের জন্য → -80 oC 16 থেকে 18 ঘন্টা (বা রাতারাতি) → তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্ক বাষ্প পর্যায়ে দীর্ঘমেয়াদী সঞ্চয়ের জন্য স্থাপন করা হয়।
(6) ফ্রিজিং স্টোরেজ পদ্ধতি 2: ফ্রিজিং টিউবটিকে একটি সেট প্রোগ্রাম সহ একটি ধ্রুবক বেগের কুলিং মেশিনে স্থাপন করা হয় এবং তারপরে একটি তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্কে স্থাপন করা হয়।
英语
阿拉伯语
���ļ���